熒光素是一種常見的生物發(fā)光報告物，用于對熒光素酶的表達進行體內(nèi)成像。這種螢火蟲熒光素酶的水溶性底物利用ATP和Mg2+作為輔助因子，在有氧的情況下發(fā)出特征性的黃綠光，在37°C的活體環(huán)境中轉(zhuǎn)變?yōu)榧t光。通過利用ATP，該反應(yīng)可進一步用于指示能量或生命的存在，從而起到生死染色的作用。
D-熒光素鉀鹽是生物技術(shù)領(lǐng)域常用的試劑，特別適用于體內(nèi)成像。通常會將熒光素酶標記的腫瘤細胞、干細胞或傳染性疾病接種到大鼠或小鼠等研究動物體內(nèi)進行研究。注射D-熒光素鉀鹽后，可通過生物發(fā)光成像(BLI)對這些模型系統(tǒng)中的疾病進展和/或藥物療效進行實時、非侵入性監(jiān)測。
在體內(nèi)成像檢測方面，D-熒光素鉀鹽如何使用呢？讓我們一起來看看吧！
一、D-熒光素鉀鹽的配制
1. 所需材料：D-熒光素鉀鹽、DPBS(不含Ca2+、Mg2+)、0.2 µm注射器過濾器
2. D-熒光素鉀鹽配制
(1)在室溫下解凍D-熒光素(鉀鹽或鈉鹽)并溶解在DPBS(不含鈣、鎂)中，最終濃度為15 mg/mL。
(2)使用5-10 mL無菌H2O預(yù)濕0.22 µm過濾器，然后倒掉水。
(3)利用準備好的0.22 µm注射器過濾器對熒光素溶液進行滅菌。
二、D-熒光素鉀鹽體內(nèi)成像檢測流程(以小鼠腹腔IP注射為例)
1. 固定小鼠并傾斜，使頭部朝下，腹部暴露。
2. 用70%乙醇消毒注射部位。
3. 建議使用25-27號針頭進行腹腔注射。將針頭以約30度角插入腹部。
4. 針頭桿應(yīng)插入約半厘米(4-5 mm)的深度。
5. 稍微抽吸以確保針頭沒有刺穿血管、腸道或膀胱。
a. 綠褐色抽吸物表示針頭刺穿腸道。
b. 黃色抽吸物表示針頭刺穿膀胱
6. 如果抽吸出任何液體，則溶液已被污染，必須丟棄并使用新的注射器和針頭重復(fù)上述步驟。
7. 如果沒有抽吸出液體，則可以繼續(xù)注射。
8. 拔出針頭，等待10-20分鐘再進行成像以獲得最大熒光素酶信號平臺期。(具體的信號峰值時間需要進行預(yù)實驗確定。)
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