一、BCA法的原理
BCA法又被稱為Smith法,是由Pierce公司的Paul K. Smith等人在1985年對Lowry法進(jìn)行改進(jìn),提出用BCA代替Folin-酚試劑而建立的(Smith, P.K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985, 150: 76-85.)。該方法的原理是,在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2+絡(luò)合,同時(shí)將Cu2+還原為Cu+,BCA螯合Cu+形成紫色絡(luò)合物,測定562 nm 的 OD 值來計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。
二、BCA如何與蛋白質(zhì)反應(yīng)
那雙縮脲反應(yīng)是如何進(jìn)行的?又是如何將Cu2+還原為Cu+的?
雙縮脲反應(yīng)原理:
首先,脲就是尿素,兩分子尿素在一定的條件下(180℃左右加熱),生成一個(gè)分子氨(NH3)縮合得到雙縮脲。正是因?yàn)樵撐镔|(zhì)是由兩分子脲縮合而成的,故名雙縮脲。雙縮脲在堿性溶液中能與極稀的硫酸銅溶液形成紫色絡(luò)合物,這個(gè)呈色反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。
雙縮脲試劑最初是指能夠提供堿性條件和銅離子、用以鑒定或檢測雙縮脲存在的試劑。由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵,因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng),且顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律,而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān),故可用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的含量。
那為什么雙縮脲反應(yīng)要在堿性條件下?
蛋白質(zhì)雙縮脲反應(yīng)實(shí)質(zhì)是肽鍵絡(luò)合Cu2+,肽鍵是酰胺鍵的一種,其pKa大約為-0.5,當(dāng)pH=-0.5時(shí),有50%酰胺質(zhì)子化,當(dāng)pH-pKa>2時(shí),幾乎所有酰胺都去質(zhì)子化。在強(qiáng)堿(pH 11.25)條件,可以促使肽鍵中N上的H+部分電離,電子云密度增大,易于和Cu2+配位,形成紫色螯合物。
BCA是如何螯合Cu+的?
當(dāng)Cu2+被蛋白還原成Cu+,Cu+與蛋白質(zhì)肽鍵的絡(luò)合能力變?nèi)酰藭r(shí)BCA競爭性、特異性地絡(luò)合Cu+,形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物。
三、BCA測定蛋白濃度流程
1. 所需試劑:
BCA試劑(常溫保存),Cu試劑(常溫保存),PBS(磷酸緩沖液)(常溫保存),BSA(牛血清白蛋白)標(biāo)準(zhǔn)品-5mg/mL(-20℃保存)
2. 檢測方法:
微孔酶標(biāo)儀法
3. 實(shí)驗(yàn)步驟:
(1)工作液配制:
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑(50:1)配制成BCA工作液,充分混勻(混合時(shí)可能會有渾濁,但混勻后就會消失)。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(建議現(xiàn)配現(xiàn)用)。
(2)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋:
取10μLBSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至100μL,使終濃度為0.5mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品按0,2,4,6,8,12,16,20μL加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中,各孔加PBS補(bǔ)足至20μL。
(3)樣品稀釋:
將樣品作適當(dāng)稀釋(最好多做幾個(gè)梯度,如作2倍、4倍、8倍稀釋),加20μL到96孔板的樣品孔中。(由于移液器在取小量樣品時(shí)誤差偏大,標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確,所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2后)
(4)含量測定:
各孔加入200μL BCA工作液,蓋上96孔板板蓋,于37°C放置15-30min。用酶標(biāo)儀測定A562nm。將各稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品的A562nm處數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel,做散點(diǎn)圖,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線公式,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出未知蛋白的濃度。
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貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
P0012 | BCA蛋白濃度測定試劑盒 | 500次 |
P0010 | BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型) | 500次 |
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