在沒有質粒提取試劑盒之前,大多提取質粒都是自己配置試劑來提取大腸桿菌中的質?!,F在的試劑盒只是改了一個名字而已,試劑還是那幾個試劑。用的原理還是那個原理:堿裂解法從大腸桿菌制備質粒,是從事分子生物學研究的實驗室每天都要用的常規技術。那么你知道DNA質粒提取的原理是什么嗎?讓我們一起來看看吧!
一、為什么用無水乙醇沉淀DNA?
用無水乙醇沉淀DNA,這是實驗中常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶,乙醇不與核酸起任何化學反應,對DNA很安全,因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在,當加入乙醇時,乙醇會奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易亍聚合。一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇(因為無水乙醇的價格比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時,就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙醇,最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。
二、在用乙醇沉淀DNA時,為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.1~0.25mol/L?
在pH為8左右的溶液中,DNA分子是帶負電荷的,加一定濃度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的負電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,易互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,當加入的鹽溶液濃度太低時,只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合,這樣就造成DNA沉淀不wan全,當加入的鹽溶液濃度太高時,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于過多的鹽雜質存在,影響DNA的酶切等反應,必須要進行洗滌或重沉淀。
三、加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再要用SDS與KAc來處理?
加進去的RNase本身是一種蛋白質,為了純化DNA,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀,再加KAc使這些復合物轉發為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物,使沉淀更加wan全。也可用飽和酚、氯仺抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到較好效果。
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