一、GoldBio熒光素原液(GLSS)的制備
1.在分子生物學級H2O中制備15 mg/mL(100X)GLSS。
a.為了獲得最佳結果,應立即使用GLSS,但可能會將其分離分成小份,在-80°C下儲存長達1個月。
2.螢光素酶發光中螢光素底物GLSS的最終濃度
含量測定應為:150μg/ml(熒光素-K為471μM,熒光素Na為468μM)。
二、GoldBio螢光素酶測定緩沖液(TMCA)的制備
在合并到TMCA中之前,將所有試劑作為分子級H2O中的儲備溶液進行制備。
1.準備一份500mM的MgCl2(100x)溶液。
a.稱取476.05 mg(95.21 g/mol)MgCl2并溶解在10 ml H2O中。
b.溶液可儲存在RT。
2.制備25mM CoA(100x)溶液。
a.稱取191.88 mg(767.53 g/mol)CoA并溶解在10 ml H2O中。
b.通過過濾器抽取5-10 ml H2O,制備0.2µm過濾器。
c.通過預濕過濾器對100x CoA進行滅菌,并在-20°c下儲存。
3.制備15mM ATP(100x)溶液。
a.稱取82.67 mg(551.14 g/mol)ATP并溶解在10 ml H2O中。
b.在-20°C下儲存。
4.制備400mM Tris-HCl,pH 7.8(4x)緩沖液。
a.稱取4.85 g(121.14 g/mol)Tris堿并溶解在85 ml H2O中。
b.用1M HCl調節pH至pH 7.8,并用H2O將體積調至100 ml。
5.在室溫下準備新鮮的2倍TMCA原料。
a.計算實驗所需的TMCA;將所有組件合并為2倍
工作濃度(在H2O中)(隨后在熒光素酶測定中降低到1x)。
示例:對于1 ml TMCA(2x):500µl Tris-HCl(4x原液)20µl MgCl2(100倍庫存) 20µl CoA(100倍庫存)
20µl ATP(100倍庫存)用H2O將體積調至1 ml。
b.如有必要,您可以在此時加入其他成分(即DTT、EDTA)。
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